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厌氧菌的分离培养与初步鉴别

查看:  发稿日期:2020-05-22 10:51
  厌氧菌(anaerobicbacteria)是一类在无氧条件下比在有氧环境中生长好的细菌,而不能在空气(18%氧气)和(或)10%二氧化碳浓度下的固体培养基表面生长的细菌。这类细菌缺乏完整的代谢酶体系,其能量代谢以无氧发酵的方式进行。厌氧菌是人体正常菌群的组成部分,广泛存在于人体皮肤和腔道的深部黏膜表面,在组织缺血、坏死,或者需氧菌感染的情况下,导致局部组织的氧浓度降低,才发生厌氧菌感染。
  厌氧菌标本的送检方法与处理
  标本送到实验室后,应在20~30min内处理完毕,最迟不超过2h,以防止标本中兼性厌氧菌过度繁殖而抑制厌氧菌的生长。如不能及时接种,可将标本置室温保存(一般认为,冷藏对某些厌氧菌有害,而且在低温时氧的溶解度较高)。
  针筒运送:一般用无菌针筒抽取标本后,排尽空气,针头插入无菌橡皮塞,以隔绝空气,立即送检。这种方法多用于液体标本的运送,如血液、脓液、胸腹水、关节液等医.学教育网搜集整理。
  无菌小瓶运送:一般采用无菌的青霉素小瓶,瓶内加一定量的培养基和少量氧化还原指示剂,用橡皮盖加铝盖固定密封,排除瓶内空气,充以C02气体。同时先观察瓶内氧化还原指示剂的颜色,以判断瓶内是否为无氧环境,如合格将用无菌注射器将液体标本注入瓶中即可。
  棉拭子运送:一般不采用棉拭子运送,如果使用该方法,一定使用特制运送培养基,确保无氧环境,确保不被污染,确保快速送检。
  厌氧罐或厌氧袋运送:将厌氧罐或厌氧袋内装入可有效消耗氧气的物质,确保无氧环境。该方法一般用于运送较大的组织块或床边接种的培养皿等。
  厌氧菌的分离培养
  厌氧菌的分离培养主要分初代培养和次代培养两个阶段,其中初代培养相对比较困难,关键的问题就是厌氧环境和培养基的选择。初代培养的一般原则是:
  先将标本涂片染色直接镜检,指导培养基的选择。
  尽量选用在厌氧菌中覆盖面宽的非选择性培养基。
  最好多选1~2种覆盖面不同的选择性培养基。
  尽量保证培养基新鲜。
  要考虑到微需氧菌存在的可能。
  选用适当的培养基接种:应接种固体和液体两种培养基;
  (1)培养基的使用,应注意下列各点:
  尽量使用新鲜培养基,2~4h内用完;
  应使用预还原培养基,预还原24~48h更好;
  可采用预还原灭菌法制作的培养基(用前于培养基中加入还原剂,如L-半胱氨酸、硫乙醇酸钠、维生素C及葡萄糖等,尽可能使预还原剂处于还原状态);
  液体培养基应煮沸10min,以驱除溶解氧,并迅速冷却,立即接种;
  培养厌氧菌的培养基均应营养丰富,并加有还原剂与生长刺激因子(血清、维生素K、氯化血红素、聚山梨酯-80等)。
  (2)培养基的选择:初次培养一般都使用选择培养基和非选择培养基。
  非选择培养基:本培养基使分离的厌氧菌不被抑制,几乎能培养出所有的厌氧菌。常使用心脑浸液琼脂(BHI)、布氏琼脂(BR)、胰豆胨肝粉琼脂(GAM)、胰胨酵母琼脂(EG)、CDC厌氧血琼脂等。
  选择培养基:为有目的选择常见厌氧菌株,以便尽快确定厌氧的种类。
  每份标本至少接种3个血平板,分别置于有氧,无氧及5%~10à2环境中培养,以便正确地培养出病原菌,从而判断其为需氧菌、兼性厌氧菌、微需氧菌或厌氧菌中的哪一类。
  厌氧培养法
  (1)厌氧罐培养法。
  (2)气袋法。
  (3)气体喷射法:又称转管法。
  (4)厌氧手套箱培养法:是迄今厌氧菌培养的最佳仪器之一。
  (5)其他培养法:平板焦性没食子酸法;生物耗氧法;高层琼脂培养法。
  厌氧状态的指示:美蓝和刃天青。无氧时均呈白色,有氧时美蓝呈蓝色,刃天青呈粉红色。
  分离培养厌氧菌失败的原因:
  ①培养前未直接涂片和染色镜检;
  ②标本在空气中放置太久或接种的操作时间过长;
  ③未用新鲜配制的培养基;
  ④未用选择培养基;
  ⑤培养基未加必要的补充物质;
  ⑥初代培养应用了硫乙醇酸钠作为唯一厌氧菌培养基;
  ⑦无合适的厌氧罐或厌氧装置漏气;
  ⑧催化剂失活;
  ⑨培养时间不足;
  ⑩厌氧菌的鉴定材料有问题。
  厌氧菌直接镜检初步鉴别
  脆弱类杆菌   G-b  两端钝圆,着深色,中间色浅且不均匀,且有气泡,长短不一
  产黑素普雷沃菌 G-b  多形性,长短不一,有浓染和空泡,无鞭毛和芽胞。标本有恶臭,琥珀味,紫外线照射发红色荧光
  具核梭杆菌    G-b    菌体细长,两头尖,紫色颗粒菌体长轴成双排列
  坏死梭杆菌    G-b    高度多形性,长短不一,菌体中部膨胀呈圆球形
  韦荣球菌     G-c    极小的革兰阴性球菌
  消化链球菌    G+c    革兰阳性呈链状的小球菌
  痤疮丙酸杆菌   G+b    排列特殊呈X、Y、V或栅状,标本有丙酸气味
  双歧杆菌     G+b    多形性,有分支呈Y、V形或棒状,标本有醋酸气味
  放线菌      G+b    分支呈棒状、X、Y、V、或栅状,脓汁中有黄色颗粒有琥珀酸气味
  破伤风梭菌    G+b    细长、梭形或鼓槌状,有芽胞,有周鞭毛
  产气荚膜梭菌   G+b    粗大杆菌,呈单或双排列,有芽胞,有荚膜
  艰难梭菌       G+b    粗长杆菌,有芽胞,有鞭毛,近来发现有荚膜
  乳杆菌        G+b    细长,有时多形性,呈单、双、短链或栅状排列
  球菌;b:bacillus,杆菌。
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